cfDNA在樣品中的含量本身有一定的差異；對于樣品本身，要注意其來源和儲存條件，血漿、血清分離的時間避免過長，凍存后注意避免溫度波動及反復凍融；在試劑盒使用過程中，建議操作人員盡量避免更換以減少操作誤差導致的得率波動

血清、血漿均可；樣品起始量根據(jù)不同產(chǎn)品在0.2-10mL之間；建議起始樣品量不少于2mL

ELISA的測定結(jié)果可分為兩種：定性測定和定量測定。前者只需確定陰性或陽性即可；后者則需要給具體的數(shù)值。在定量測定中，經(jīng)常要將標準品所獲得的吸光值進行標準曲線的繪制

讀板時要保證酶標板清潔，同時也要注意酶標儀的波長是否已調(diào)至合適或所用濾光片是否正確。 通常，單波長讀板的測定值一般是指以對顯色具有最大吸收的波長如450nm或492nm進行比色測定；而雙波長讀板的測定值一般是敏感波長如450nm的吸光值與非敏感波長下如630nm的吸光值之差，可排除板內(nèi)臟物的影響。同時，由于ELISA測定中單個空白孔的非特異吸收上有一定程度的不確定性，也就是說每次測定或同次測定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度測定值，故而在ELISA測定比色時，最好是使用雙波長比色

目前以HRP作為標記酶的商品ELISA試劑盒中，如以TMB為底物，則提供的底物為A和B兩瓶應用液；如以O(shè)PD為底物，則試劑盒提供OPD片劑或粉劑，臨用前配制。顯色劑配制后放置時間過長（肉眼可見淺藍色的TMB時）要棄之不用。在加入底物開始顯色反應前，最好是先檢查一下底物溶液的有效性，即可將A和B兩種液各加一滴于清潔的空板孔或eppendorf管中，觀察是否有顯色出現(xiàn)，如有，則說明底物已變質(zhì)。 顯色反應條件一般為37℃或室溫反應15-30分鐘。加終止液時，要避免氣泡產(chǎn)生而引起的假陽性

為了確保ELISA測定的特異性，洗板可清除非特異性結(jié)合物質(zhì)，減少背景信號，增加分析的信噪比。 手工洗板時，拍板要垂直，避免交叉污染，用力不能過猛，防止抗原抗體復合物脫離。使用半自動洗板時，應經(jīng)常檢查沖洗頭是否通暢，若被雜物堵塞時可用注射器針頭挑出。為了達到較好的洗滌效果，實驗室可采用機器與人工洗滌相結(jié)合的方法，即在機器洗滌后再進行人工洗板1-2次。 以HRP作為標記酶的ELISA試劑盒中使用的洗板液一般為含0.05% Tween20的中性PBS，其中，吐溫20的濃度可在0.05%-0.2%之間，高于0.2%時，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低實驗的靈敏度

一般孵育時間與溫度成反比，即溫度越高，所需時間相對較短。最常用的孵育溫度為37℃，孵育1-2h。 孵育時應貼封片或加蓋，避免樣品或稀釋液蒸發(fā)，吸附于孔壁，難于清洗。孵育時，反應板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。同時，應嚴格控制孵育時間，避免因時間過長導致緊附于反應孔周圍的非特異性結(jié)合。 孵育時，要盡量排除“邊緣效應”，即96孔板的外周孔顯色較中心孔深。究其原因，是因為96孔板周孔與中心孔的表面或熱力學特征不同。因此，可采用水浴或在將反應溶液加入至板孔中時，將板和溶液均加熱至孵育溫度（37℃）

因ELISA的靈敏度較高，則應該按規(guī)定將血清稀釋至適當?shù)谋稊?shù)，以降低非特異性反應，使特異性的抗原抗體反應充分體現(xiàn)出來。 加樣品時，單孔用量要求：≥20ul/指標，如需要做2個復孔則血量≥60ul/指標。如果用量充足，最好提供50ul/孔/指標。具體用量也需根據(jù)試劑盒的要求而定。 吸取樣品時，加樣槍頭不應粘附多余的液體；加樣時不可90度向孔中滴加液體，否則會導致液體殘留在吸頭上，加樣不準確。正確加樣方法應為45度，吸頭貼著孔壁和液面的交界處加入。加樣時速度不可過快，否則無法保證微量加樣的準確性和均一性；要避免樣品加在孔壁上部而產(chǎn)生非特異性吸附。不可將樣品濺出以避免對鄰近孔產(chǎn)生污染